Nature Communications | 活化T细胞分泌含有DNA的外泌体启动树突状细胞抗病毒反应

西班牙的Sánchez-Madrid F教授研究团队在Nature子刊发表了题为“Priming of dendritic cells by DNA-containing extracellular vesicles from activated T cells through antigen-driven contacts”的研究，揭示了抗原递呈细胞——树突状细胞(DCs)在与T细胞接触，促进T细胞活化的同时，T细胞也会反作用于DCs，使其启动抗病毒程序。主要机制是活化的T细胞通过包含基因组和线粒体DNA的胞外囊泡，活化胞质DNA感应通路cGAS/STING和IRF3依赖的干扰素调节基因的表达，诱导DCs的抗病毒反应。这种固有免疫细胞和适应性免疫细胞的相互作用增强机体抵抗未知威胁的反应能力。

1. T细胞分泌含有基因组和线粒体DNA的外泌体(鉴定外泌体及其内容物)

分离人原代淋巴母细胞来源的外泌体进行NTA分析（b），其包含的多肽GO胞内成分分析（c）,发现大部分多肽属于胞核和线粒体成分。同时WB鉴定外泌体特征性marker蛋白CD81和TSG101，同时含有mtDNA结合蛋白——线粒体转录因子TFAM和线粒体拟核形成蛋白ATAD3（d），通过蔗糖密度梯度离心，发现外泌体蛋白CD81、TSG101和线粒体蛋白TFAM、ATAD3存在同一层，说明mtDNA结合蛋白存在于外泌体上（e）。

2. 不同方法证明外泌体中含有线粒体和核DNA

人原代T细胞来源的外泌体的DNA深度测序分析，发现外泌体中含有核序列和整个线粒体基因组序列（a）；通过PCR验证分析外泌体中的DNA属于线粒体基因组和B2M核基因（b）;外泌体经DNA酶处理后，还保留部分DNA内容物，但是经DNA酶和脂质去稳定剂处理后，DNA内容物就完全检测不到了（c）。通过蔗糖密度梯度离心分离，发现外泌体蛋白CD63和TSG101所在那层也存在mtDNA（d）;流式检测发现CD81和DNA双阳性的外泌体，经过通透剂处理后，CD81和DNA双阳性的外泌体比例明显增高（e），说明外泌体表面和里面都含有DNA。利用anti-OHdG抗体检测发现外泌体中存在被氧化的DNA（f左图），同时利用氧化DNA抗体和总DNA抗体免疫沉淀后，qPCR分析氧化mtDNA在外泌体中的丰度高于细胞内的（f右图）。

3. 线粒体mtDNA和相关蛋白进入外泌体的分子机制

线粒体mtDNA结合蛋白SSP1与CD63共定位的情况更倾向于出现在晚期内体，而不是早期内体（a）；Rab7 (Q67L)有利于增强晚期内体的形成，Rab7 (Q67L)过表达后促进内源性线粒体蛋白TFAM聚集在Rab7阳性的内体结构中，同时与靶向线粒体的红色荧光蛋白标记的线粒体蛋白共定位（b），说明内体途径与外泌体中线粒体物质的分泌有关。利用shRNA靶向中性鞘磷脂酶2（nSMase2），抑制外泌体的生物合成，减少了外泌体蛋白、mtDNA结合蛋白和mtDNA的释放（c）。利用shRNA靶向nSMase2和Rab27a会增加线粒体质量、胞内TFAM水平和ROS水平、DNA氧化损伤（d），同时线粒体在电镜下的形态和嵴的分布（线粒体嵴变宽）出现改变（e）,从而导致线粒体的氧化磷酸化呼吸功能下降（f），说明通过外泌体释放线粒体物质有助于维持线粒体平衡和mtDNA代谢。无血清培养细胞诱导自噬后，减少外泌体的分泌，同时也减少了线粒体成分的胞外释放（g）。相反，利用bafilomycin-A1抑制自噬或者siRNA干扰自噬介导基因LC3后，既不会改变外泌体的大小和浓度，也不会改变外泌体中线粒体蛋白TFAM的检测（g、h），说明线粒体蛋白和DNA的转运、分泌进入外泌体的过程与大自噬无关。

4. 通过免疫接触的形式转移DNA和线粒体成分

过表达靶向线粒体荧光蛋白mitoDsRed的J77 T细胞分泌的外泌体与Raji B淋巴母细胞共孵育后，Raji B淋巴母细胞获得了荧光蛋白（a）。作者利用两种具有相同核基因组和不同线粒体基因组的转基因小鼠，通过RFLP分析，C57C57小鼠T细胞分泌的外泌体与C57NZB小鼠BMDCs共孵育后，DCs中存在C57C57的RFLP片段（b），说明细胞通过外泌体转移线粒体成分和mtDNA。通过SEE抗原预先刺激Raji B细胞后，抗原递呈给表达mitoYFP或者TFAM-DsRed的TCR Vβ8+ J77 T细胞，流式检测发现mitoYFP或者TFAM-DsRed荧光从T细胞转移到B细胞，并呈现抗原依赖的方式（c）。体内实验：C57NZB小鼠来源的BMDC递呈OVA抗原，活化C57C57 OT-II小鼠的CD4+ T细胞，发现只有在APCs中检测到T细胞的mtDNA；C57C57小鼠来源的BMDC递呈OVA抗原，活化C57NZBOT-II小鼠的CD4+ T细胞，也得到同样的结果（d-f）。

5. 外泌体转移DNA活化cGAS/STING-IRF3信号通路

RNA深度测序分析经过T细胞外泌体共孵育后DCs的基因表达谱，超过1600中基因发生了变化，外泌体主要影响了参与I型干扰素反应和抗病毒活性的基因表达（a），通过GO注释分析，提示外泌体影响的基因主要涉及IFN信号通路、外源性DNA和RNA感应、细菌和病毒识别、固有免疫和适应性免疫细胞的交互作用过程（b），这些结果提示T细胞外泌体启动了DCs的抗病毒固有免疫反应，上调了抗病毒和抗细菌感染反应的基因表达，以控制病原感染和复制（c）。同时qPCR验证了外泌体可以上调ISGs基因表达，而STING缺陷会下调外泌体诱导的ISGs基因表达（d），IRF3缺陷则会完全抑制外泌体诱导的ISGs基因表达（f），DNA酶预处理外泌体后明显抑制外泌体诱导的干扰素相关基因的活化（g）。细胞感应到DNA会激活 cGAS/STING通路，而外泌体诱导了DCs中STING的聚集（e）。以上结果提示，DNA存在T细胞外泌体的表面和里面，并通过外泌体转移到DCs，活化cGAS/STING-IRF3信号通路，启动DCs的抗病毒反应。

6. 抗原驱动的T-APC免疫突触是否通过传递外泌体成分启动APC抗病毒反应？

DCs通过与OT-II CD4+T细胞接触后上调ISGs表达（a）,经SEE抗原刺激的Raji B细胞与表达CD63GFP的J77 T细胞共孵育后，流式检测B细胞的GFP表达情况，反应其摄取T细胞外泌体的情况，根据GFP表达高低分类，GFP表达高的Raji B细胞会高表达Cxcl10基因，提示在抗原依赖的免疫突触中外泌体转移启动了DCs的抗病毒反应（b）。为了进一步检测DCs增强的抗病毒反应，DCs预先与T细胞外泌体共孵育后，再感染GFP阳性的重组疫苗病毒，明显减轻了DCs感染病毒的情况（c）。在抗原存在情况下，DCs与T细胞共孵育后，再感染GFP阳性的重组疫苗病毒，明显减轻了DCs感染病毒的情况（d）。在抗原存在情况下，通过manumycin A抑制T细胞分泌外泌体后，DCs与T细胞共孵育后，再感染GFP阳性的重组疫苗病毒，无法保护DCs不被病毒感染（e）。这些结果提示T细胞外泌体通过抗原依赖的突触增强DCs的炎症反应，保护其不被病毒感染。

总结： 首先作者对于DCs能活化T细胞，而T细胞对DCs功能有什么作用，通过什么起了作用的相关分子机制进行了深入的探讨。通过引入T细胞分泌的外泌体，挖掘外泌体中包含的DNA起了关键的作用，与之前解读的文章关于外泌体中的ncRNA和蛋白质不一样，让研究人员对外泌体的核酸的功能有了新的认识。抗原驱动下形成的T细胞和DCs的免疫突触中，T细胞通过分泌含有基因组和线粒体DNA的外泌体，而后被DCs摄取，其DNA被受体感应后，活化cGAS/STING-IRF3信号通路，上调ISGs基因，启动DCs的后续抗病毒反应。这也是固有免疫和适应性免疫细胞的交互作用共同抵抗病原体感染的新机制。

参考文献

1. Torralba D, et al.. Priming of dendritic cells by DNA-containing extracellular vesicles from activated T cells through antigen-driven contacts. Nat Commun. 2018. DOI: 10.1038/s41467-018-05077-9.